ROS活性氧检测试剂盒
活性氧(ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2·-)。超氧阴离子遇水生成H2O2，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(MAO)的作用下生成，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH·，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。
本试剂盒中的CellROX Green本身荧光较弱，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，氧化产物可掺入染色体DNA中，荧光强度增大，产生明亮的绿色荧光。根据活细胞中绿色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。在激发波长488nm，发射波长520nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
试剂盒特点：
● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
● 背景低，灵敏度高；
● 线性范围宽，使用方便。
试剂盒组成：
组份 200-1000T 400-2000T
组份A：CellROX Green荧光探针 100μL 100μL×2
组份B：活性氧阳性性对照诱导剂 1mL 1mL
储存条件：-20℃避光保存。有效期6个月。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488nm，发射波长520nm。
● 离心机
● 移液器
● PBS缓冲液
● 或者HBSS（无酚红）
检测方法：
● 流式细胞仪
● 荧光显微镜
● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞
● 贴壁细胞
使用注意事项：
● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
● 对于药物作用时间较长(6h以上)的细胞，先用阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。
● 阳性对照诱导剂可以按照1:1000的比例使用。例如标记好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。
● CellROX Green在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
● 对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化，很多细胞内的ROS绝对水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。
● CellROX Green不可以一次性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。
● 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
使用方法：
CellROX Green探针配制：
根据需要用量，用新鲜无血清培养基或HBSS/PBS稀释CellROX Green探针后充分混匀，避光保存备用。
● 不能用含有血清的培养基稀释探针。
探针使用终浓度200-1000倍稀释。一般预实验起始浓度按500倍即可。
CellROX Green探针标记：
CellROX Green溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲液或组织灌流液中稀释到所需浓度，终浓度200-1000倍稀释，以此染色液更换细胞培养基或灌流液；也可直接向无血清细胞孵育液体或灌流液中加入CellROX Green探针溶液至所需浓度。
● 检测贴壁细胞时，荧光显微镜检测可以原位染色也可以消化下来后染色，流式检测消化下来后染色。
依据细胞ROS含量的不同，CellROX Green终浓度可选择在200-1000倍稀释的范围，孵育时间可选择30分钟-4小时，在37℃或室温进行避光孵育。
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