【分子克隆】第十一期：慢病毒载体

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

慢病毒属于逆转录病毒科，能够感染分裂和非分裂的细胞，从而将它们与普通的逆转录病毒区别开来。慢病毒基因组由两个拷贝的单链RNA组成，并被结构蛋白和酶蛋白包裹在衣壳中，这些结构蛋白和酶蛋白包括逆转录酶（将RNA转化为dsDNA）和DNA整合酶（将dsDNA整合到宿主基因组中）。

慢病毒

图1. 慢病毒的产生和转导

如上图步骤｜，用包膜、转移和包装载体转染慢病毒包装细胞系。包膜、转移和包装载体转录的mRNA分别被翻译成：通过内质网进入细胞膜的病毒包膜蛋白（2a）；单链RNA病毒基因组（2b）；病毒结构蛋白和酶（2c），这三种成分组装成病毒颗粒，从宿主细胞膜上出芽。

如上图步骤‖，病毒颗粒通过包膜蛋白附着在宿主细胞表面受体上，病毒与宿主质膜融合释放结构蛋白、酶蛋白和病毒基因组。病毒RNA被逆转录成双链DNA，并与整合酶形成预整合复合物，整合酶通过核孔复合物，催化病毒DNA整合到宿主基因组中，最后转移载体启动子驱动转基因表达。

人类免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）作为典型的慢病毒，其基因Gag、Pol和Env分别编码结构核心蛋白、逆转录酶和整合酶以及包膜糖蛋白；Tat和Rev参与病毒复制：Tat启动病毒基因组转录，并受长末端重复序列驱动，Rev促进病毒mRNA的核输出，并受到Rev响应元件的调控；包装信号(Ψ)是将病毒基因组进入衣壳的关键。此外，HIV-1基因组中包含的毒力因子Vif、Vpr、Vpu和Nef会干扰宿主防御机制，并包含在组装好的病毒粒子中。（图2）

图2. HIV基因组

慢病毒是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。

第一代慢病毒载体将所有包装元件编码在一个载体上，生物安全风险较高；

第二代慢病毒载体去除了毒力因子并将包膜从包装载体中分离，提高了安全性并增强了病毒复制，而不干扰有功能的病毒粒子的生产。此外，3’LTR包含U3缺失，可以消除病毒基因组复制的启动子活性，并在不影响病毒粒子滴度或转基因表达的情况下自灭活载体。

第三代慢病毒载体从包装载体中去除Rev，并用转移载体上游的一个组成启动子替换Tat，是目前被广泛应用的慢病毒包装载体。（图3）

图3. 第2代和第3代慢病毒系统示意图

慢病毒（LV）感染细胞的过程

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