肿瘤微环境可影响肝癌免疫固有淋巴细胞转化和

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　文献来源：Heinrich, Bernd, et al. "The tumour microenvironment shapes innate lymphoid cells in patients with hepatocellular carcinoma." Gut(2021).PMID: 34340996.

　　研究意义

　　既往研究确定了2型固有淋巴细胞（innate lymphoid cells, ILCs）在小鼠肝纤维化发展中的作用，但ILCs在人类肝细胞癌（HCC）中的生物学功能仍不清楚。关于肝癌肿瘤微环境中调控ILCs的细胞因子的动态变化知之甚少。本项研究发现调控ILCs的细胞因子在非肿瘤和肿瘤组织中差异表达，并与TCGA-HCC队列中的预后相关。ILCs的轨迹分析可用于确定肿瘤中非肿瘤ILCs向ILC2和非细胞毒性ILC1s的转录组学和表型转变。来源于HCC的细胞因子可在体外诱导ILC2定向可塑性改变。肿瘤中ILCs的组成可用于HCC患者的分层。肿瘤中IL-33表达较高的患者显示出较高的ILC2/ILC1比率，与较高的生存率相关。临床应用：调控细胞因子梯度以影响ILCs转化，可用于改善HCC的抗肿瘤免疫反应。

　　肝细胞癌（HCC）是一种典型的炎症相关肿瘤。驻留于组织的固有淋巴细胞（ILCs）已被建议用于调控肿瘤免疫监视。本文研究了局部细胞因子环境如何调控HCC中的ILCs。作者对来自48名HCC患者的肿瘤组织进行了大样本RNA测序，并对其瘤旁正常肝组织、边缘和肿瘤核心富集的ILCs进行了流式细胞术和单细胞RNA测序。此外，作者通过在单细胞水平同时检测蛋白质和RNA表达鉴定了ILCs亚组的精确特征。

　　结果发现：（1）肿瘤、非肿瘤和边缘的RNA测序结果呈现梯度差异，这种差异与患者存活率低以及ILCs的可塑性调控有关。（2）来自HCC肝脏的ILCs的单细胞RNA测序和流式细胞术鉴定出了非肿瘤组织中的NK细胞，当它们转变成肿瘤ILC1和NK样ILC3细胞时失去了其细胞毒性特征。（3）肿瘤ILCs组成由细胞因子梯度介导，这种梯度能够促进ILCs转变为活化的ILC2，并且这一结果具有肝脏特异性。（4）具有高ILC2/ILC1比率的患者在肿瘤中表达更多的IL-33，进而促进ILC2的分化，并与更好的预后相关。

　　因此，本文证实了肿瘤细胞因子环境调控ILCs组成和HCC预后，细胞因子的特定变化通过诱导ILCs可塑性和功能改变来调控肿瘤中ILCs的组成。

　　研究思路

　　结果解读

　　1、肿瘤微环境中细胞因子的表达与预后相关

　　为探索肝脏微环境中细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和生长因子的表达特征，作者对来自肝癌患者肿瘤（T）、肿瘤边缘（M）和非肿瘤组织（NT）样本进行RNA测序及差异基因表达分析，结果显示，T、M和NT之间的基因表达差异巨大。

　　在蛋白质水平上，作者使用多重细胞因子分析法分析了来自T和配对NT的组织上清液，发现14种细胞因子呈现浓度差异。相应转录本的特征与TCGA-LIHC队列中的生存率相关，即高表达TGFB2、IL6、IL8和IL10的患者及低表达IL1B、IL23A、IL17A、CD40LG、IL2、IL15、IL12A、IL9、IL33和IL4的患者生存率较低。

　　有趣的是，在差异表达的细胞因子基因中，有三种细胞因子（IL-1β、IL-33和TGFβ）可影响ILCs的可塑性和功能，这三种细胞因子在T、M和NT中也存在明显表达差异。此外，高表达IL-33( ILC2激活细胞因子)与TCGA队列中更好的预后相关。

图1、肿瘤微环境中细胞因子的表达与预后相关

　　2、T、M及NT中ILCs的分布分析

　　作者分析了48例肝癌患者的肝脏样本，并从肿瘤（T）、肿瘤边缘（M）和非肿瘤组织（NT）以及外周血中分离出单个核细胞。随后，通过流式鉴定出Lin+细胞，其余Lin-细胞用CD127等ILCs表面标记物进行染色。结果显示，ILCs（CD127+lin-）在T、M和NT中的分布存在差异，即非肿瘤到肿瘤组织中的ILC1和ILC2占比增加，而ILC3占比降低。

　　除CD127+ILCs外，作者还鉴定了CD127- lin-细胞群，这种细胞具有NK细胞和ILC1的共同特征，定义为“NK样细胞”。大多数 NK 样细胞表达 CD56，其在肿瘤中的表达降低，而c-Kit +（CD117 +）NK 样细胞，在肿瘤表达增加。

图2、T、M及NT中ILCs的分布分析

　　3、HCC中ILCs的转录特征

　　为了更好地了解肝癌中ILCs组成的异质性，作者利用单细胞多组学技术，将靶向转录组扩增数据与膜蛋白检测相结合，深度解析了肝癌ILCs各亚群的转录本及蛋白表达特征。

　　首先，scRNA-seq分析显示ILCs分布与流式结果相匹配。其次，通过单细胞聚类和t-SNE分析确定了主要的ILCs分群（ILC1s、ILC2s、ILC3s和NK样细胞）及12个细分亚群。最后，ILCs在非肿瘤、癌旁及肿瘤组织中的占比与流式结果相似，ILC2和NK样细胞亚群主要来源于肿瘤组织，具有较典型NK marker的NK样细胞则主要存在于非肿瘤组织。ILC3s作为ILC主导亚群存在于所有区域。