经验分享：高分辨熔解曲线分析技术在分子诊断

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

该技术通过在反应体系中加入饱和DNA双链荧光染料，PCR反应结束后进行DNA双链产物升温解链反应获取荧光信号。随着温度的升高，DNA双链氢键逐渐打开，荧光染料释放，荧光强度逐渐降低。不同核酸片段有特征性的温度-荧光强度变化曲线(即熔解曲线)。只有单一碱基的改变也能通过熔解曲线不同(主要表现为形状不同和熔解温度不同)表现出来。即使对于第四类单核苷酸变异(single nucleotide variations, SNVs)，依据“相邻碱基”理论(nearest-neighbor theory)预测其熔解温度差值(ΔTm)为0.0℃，应用高分辨熔解曲线分析方法仍能将其区分开[4-6]。

2 高分辨熔解曲线分析技术构成

高分辨熔解曲线分析技术主要依赖于含有饱和DNA双链荧光染料、目的片段设计优化了的PCR靶标片段，能够有效控温获取高分辨熔解曲线信号的仪器系统和熔解曲线软件分析系统。

2.1 含饱和DNA双链荧光染料的特异PCR靶标片段获取

DNA双链荧光染料有很多，但饱和DNA双链荧光染料，是实现高分辨熔解曲线分析检测的基础。Real-time qPCR常用的SYBGreen是不饱和双链DNA染料，可以通过粗略的熔解曲线分析判断PCR产物的特异性，但无法精确实现基因分型和变异检测[7]。饱和双链染料能最大限度与PCR产物结合而不抑制PCR反应，稳定表现出目的片段对应的熔解曲线特征[3]。目前商品化的饱和双链染料有多种，如LCGreenⓇ plus(Idaho technology)、SYTOⓇ 9(Invitrogen)、EvaGreenⓇ (Biotium)等[8]。另外，依据待检测基因序列构成、变异位点、变异类型等不同，设计合适长度和GC含量的PCR产物也是必要的。一般来说，目的片段越短，越有利于变异位点检出，但有些基因片段当长度适当增加，或增加为多个熔解结构域(melting domain)时更有利于基因分型和变异检出[4, 9]。在目的基因片段熔解曲线分析前，可以通过熔解曲线预测软件预测熔解曲线形状和Tm值(多少个熔解结构域及大致的温度范围等)设计优化目的片段[10-12]。

2.2 高分辨熔解曲线分析仪器

所有real-time PCR仪都具有升降温控制系统和荧光信号采集的功能，但并不是都能用于高分辨熔解曲线分析。现在商业销售的大多real-time PCR仪都添加了专门的HRM模块和通道进行熔解曲线分析，但仪器设计原理、构造各不相同，以致检测时间、检测通量、检测准确性、敏感性、特异性等方面都存在差别(表 1、图 1)[13-14]。高分辨熔解曲线分析是依靠区分熔解曲线之间的差异发现目的基因变异。基因序列、基因片段长度、基因变异类型(插入/缺失突变、点突变、多碱基点突变之间)都会影响熔解曲线的变化，进而影响变异型与野生型熔解曲线间的区分。目的片段长度增加常导致熔解曲线差异的缩小；有些基因变异类型，如三类(C/G)和四类(T/A)SNVs，熔解曲线变化也很小(Tm值变化＜0.4℃)，即使其他条件足够优化，熔解曲线间的误差也可增加基因变异检出的假阳性或假阴性率[15]。因此仪器控温的精确度直接影响熔解曲线分析结果。通常认为空气控温和单样品上样模式仪器的控温效果好于加样板上样模式为基础的仪器，另外单一样品序贯检测或单一样品光纤检测的仪器要优于全加样板一起检测的仪器[13-14, 16-17]。

4种目的片段长度具有同一SNV位点纯合子基因分型准确率在10种HRM仪器平台检测结果比较

2.3 高分辨熔解曲线数据分析

高分辨熔解曲线法检测获得的原始数据是一系列荧光强度对温度的数据点，将这些原始数据点进行数学转换，生成原始平滑曲线是数据分析的基础。分析数据之前，需要观察原始曲线，如果出现了非特异性产物的熔解曲线或是PCR产物量过少(熔解前后荧光强度变化很小)时，会影响目的片段基因分型或基因变异判别的结果，均不应进行下一步的分析。高分辨熔解曲线检测需要优化PCR反应，避免非特异性扩增，并保证产物量充足。一般高分辨熔解曲线数据分析主要包括：荧光背景(噪声)去除，曲线标准化(Normalization)；空间位置差异校正(curve overlay或temperature shifting)；一阶负导数曲线生成(negative first derivative curve)和差异曲线生成(difference curves)等[3, 18]。HRM仪器一般都自带软件分析系统，但一些商业软件设计存在固有缺陷，如没有背景噪声去除，没有负导数曲线分析等，限制了数据有效分析。作者在前期比较1600多例第四类SNV纯合子基因分型样品准确率时发现，应用Bob Palais教授等开发的专门针对HRM分析的MW软件分析准确率显著高于商业软件分析结果[14]。

3 高分辨熔解曲线分析在分子诊断中的应用