技术｜一文读懂化学发光免疫测定
01 简介
近年来，化学发光免疫测定（CLIA）因其灵敏度高、特异性好、应用范围广、设备简单、线性范围宽等特点，在生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全和药物分析等不同领域得到越来越多的关注。传统的免疫测定总是需要很长的孵化时间，这又导致整个分析需要几个小时才能完成，所以产量和应用范围在很大程度上受到限制。研究人员设计了不同的方法，通过改善质量运输和反应动力学来缩短分析时间。免疫测定扩大了CLIA的应用范围。
与第三代EIA相比，化学发光免疫测定通常被认为是第四代测定法。这是因为CLIA的灵敏度明显提高，信噪比高。
02 什么是化学发光法？
“化学发光”一词是由Eilhardt Weidemann（1888年）首次提出的。化学发光，是指当外源性反应的振子兴奋产物松弛到其基态并发射光子时所观察到的现象，可以用简单的术语来定义：发出光的化学反应。化学反应产生足够的能量（蓝光发射约300 kJ/mol，红光发射约150 kJ/mol），以诱导电子从其基态过渡到激发电子态。这种电子转换往往伴随着分子的振动和旋转变化。
在有机分子中，最经常遇到的是从π键轨道到π*反键轨道（π→π*）或从非键轨道到反键轨道（n→π*）的转变。因此，电子返回基态并发射光子被称为化学发光。被激发的分子也可以通过发生化学反应、碰撞失活、内部转换或系统间交叉而失去能量。从分析的角度来看，这些辐射较少的过程是不可取的，因为它们与化学发光竞争（见下图）。
当两个分子发生化学反应，从而有能量释放时（放热反应），这种能量有时不是表现为热，而是表现为光。这是因为能量激发了它所流入的产物分子。处于这种激发状态的分子要么放松到基态，直接发光，要么将其能量转移到第二个分子，后者成为发光体。这个过程被称为化学发光（见下图）。
A+B→AB*→产物+光
03 化学发光免疫测定（CLIA）的原理
在抗原和抗体存在的情况下，抗体的结合区与抗原的表位结合，形成抗原-抗体或免疫复合物。通过使用标记的抗体来估计这种免疫复合物的水平是CLIA的基础。它涉及使用涂有感兴趣的抗原或抗体的固定固体相。这导致了光的产生，其强度与存在的标记复合物的数量成正比，并间接地帮助对感兴趣的分析物进行量化。光的强度是以相对光单位（RLU）来衡量的（见下图）。
这项技术的主要优势包括灵敏度和不受背景信号影响的能力。另外，根据这一原理工作的分析仪在设计和操作上都很简单。
04 化学发光免疫测定（CLIA）的基本组件和要求
CLIA反应的基本组件和要求有：
4.1、固相载体
包括Ag-Ab在内的所有反应和所有后续反应（直到产生光）发生的地方。
a) 在CL反应中发出的光是各向同性的--它在所有方向上的发射是相同的。如果CL反应是在透明板的孔中进行的，那么光不仅向检测器的方向垂直辐射，而且还向其他孔横向辐射。光线很容易通过平板材料本身传播，这种现象被称为光管道。由于这个原因，CLIA绝不应该在透明板中进行。相反，必须使用不透明的平板。有两种不透明的平板可供选择。黑色和白色。使用黑板时，由于光的吸收，信号通常会减少10倍。
最好的选择是使用具有均匀不透明度的白色板。最近的一个突破是在反应单元之间尽量减少光管道和由此产生的串扰，在反应单元上涂上一层钛。钛，具有复杂的网状工作结构，可以大大减少光管道和串扰（见下图）。
a) 固体相必须允许有效吸附Ag或Ab作为捕获物。
b) 最佳的捕获浓度是至关重要的。防止钩子效应并确保灵敏度。
c) 捕获的高特异性可以防止假阳性。
4.2、信号试剂
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