单细胞分离技术大揭秘
上一讲中我们已经了解到单细胞测序的重要性及应用方向。
而单细胞测序日趋火爆的原因很大程度上得益于单细胞分离技术的不断完善。这一讲，我们将跟大家一起回顾传统的单细胞分离技术，并重点介绍单细胞分离技术的新宠微孔芯片技术及微流控技术。图1为目前常见单细胞分离设备。
图1：目前常见单细胞分离设备
传统单细胞分离技术
相信许多实验人员，都见过下面我们要介绍的传统的单细胞分离设备。传统的单细胞分离方法主要有：口吸管技术、显微操作法、激光显微切割法及流式细胞法。
利用口吸管技术，操作者可以在显微镜下选择形态较好的细胞，对细胞几乎无损伤，因此下游实验的成功率非常高，但对操作人员的熟练度要求较高，见图2。
图2：显微镜下采集单细胞
手工操作分离单细胞费时费力。而显微操作仪的发明解放了人手，使得整个操作过程更加简单可控。利用显微操作仪，见图3，操作者可以通过手动或者自动化的办法实现单细胞获取。与口吸管相比，显微操作的优势在于能够通过仪器准确地控制单细胞的吸取与释放，因此对操作人员自身的技术要求降低。
图3：Eppendorf显微操作仪
利用激光显微切割仪，见图4，操作者可以将组织内单一细胞或细胞群切割下来进行研究，避免间质细胞及一些炎症细胞造成背景“污染”，可以了解到细胞的位置信息。但该方法相邻细胞容易污染，另外在组织固定及激光切割的过程中可能会破坏细胞的完整性，对细胞核酸损伤较大，从而影响后续的遗传物质的扩增。
图4：ArcturusXTTM激光显微切割仪
流式细胞仪，原理见图5，能够对鞘液包裹着的单细胞实现散射光及荧光的检测。分选型的流式细胞仪通过对鞘液施加超高速震动使液流形成液滴，并进行瞬时充电。包裹单细胞的带电液滴经过高压电场后发生偏转，进入收集装置中，从而实现细胞的分离。
流式细胞仪技术能够很好的实现大量细胞及复杂样本的分选，并且能够做到精度高、通量较大（96或384）。但是流式机械剪切力比较大，影响细胞活性，同时要求的细胞数量多，对于一些无法获取足够数目细胞的项目来说是不适用的。
图5：流式细胞分选仪分选原理
以上传统的单细胞分离技术可以帮助研究者获取单个细胞，但并不能同时做到下游的扩增。需要操作者对分离到单个PCR管中的细胞进行后续的裂解、扩增及建库，仍然需要繁琐的操作。因此我们下面将重点介绍新型的高通量单细胞分离技术－微孔芯片技术及微流控技术。
新型高通量单细胞分离技术
目前新型高通量单细胞分离技术主要有微孔芯片技术及微流控技术。
微孔芯片技术是指通过制作个孔径略大于细胞直径的微孔阵列，通过重力、流体、电场等方式将细胞悬液中的单细胞分离至微孔中的技术。
目前隶属于Takara Bio的WaferGen生物系统公司于2014年推出了ICELL8TM Single-Cell System（图6），通过MultiSample NanoDispenser（MSND）能够准确的对ICELL8芯片上搭载的5184个微孔进行分注。成像阶段可以得到各个微孔的图像，结合专用软件CellSelect自动选择单细胞进行后续的实验。
图6：ICELL8TM Single-Cell System成像分析
Alex K. Shalek等开发了便携式单细胞分离技术可以快速和低成本地进行单细胞RNA测序。他们设计了捕捉单个细胞的纳米微孔阵列，见图7，用有条形码的磁珠捕获RNA片段。仅需要移液枪即可实现单细胞的高通量分选。Seq-well过程能够很好捕获和分析序列约每个细胞10至15%的RNA转录本。
图7：Seq-well（Nature Methods 14, 395–398 (2017)）
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