再造基因组编辑系统

作者：张馨予

仅仅数年间，使用 CRISPR（规律成簇间隔短回文重复）/ Cas9 进行基因组编辑在科研上激起了巨浪，该技术使研究人员能够精确而方便地编辑特定的基因。然而，新技术也存在一些缺点，例如在错误的地点切割 DNA，甚至是随机地进行 DNA 编辑。

但是科学家们很快开始将 CRISPR 拉回了正确的轨道，如今创新性的分子特性使它更好地作用并能用于更多类型的细胞。CRISPR 应用的迅速出现意味着艾滋病、癌症、镰状细胞病等其他疾病的临床试验出现了端倪。

今天的 CRISPR 技术对于更多研究者来说也是一个尖端的工具，与其他基因调控方法相比，更适应于未来的医疗应用。“回到 RNA 干扰（RNAi）时代，感觉就像进入了超光速飞船。” 整合 DNA 技术公司的高级副总裁和首席科学官 Mark Behlke 说，该公司提供 RNAi 和 CRISPR 的试剂。“但现在 CRISPR 使它看起来像一个孩子的游戏，实在令人惊讶。”

相比于其他基因编辑方法，如 TALENs（类转录激活因子效应物核酸酶）和锌指核酸酶， CRISPR 更加快捷便宜，也更易于使用，从而快速地被许多领域的科学家所接受。例如，癌症研究人员将包含编码 CRISPR 向导 RNA（guide RNA）和 Cas9 （CRISPR 关联蛋白 9）的质粒 DNA 转入细胞系中，创造出对应不同研究的癌细胞系。

然而斯坦福大学医学院副教授，儿科医生 Matt Porteus 对于 CRISPR 起初有着不同的体验。他说，“每个人都表示 CRISPR 会帮助解决世界上的所有问题，但当我们试图将细胞中的 CRISPR DNA 质粒应用在我们认为重要的治疗中，如造血细胞系或其他原代人类细胞类型，该系统根本不起作用。” 因此，Proteus 实验室研制出的一种在人原代细胞中进行 CRISPR/Cas9 编辑的不同递呈方法，完全不需要 DNA 质粒。

该方法的变化在于通过核糖核蛋白（RNPs）形式将 CRISPR/Cas9 试剂引入细胞。“研究人员将这些试剂（gRNA 和 Cas9 蛋白）组合起来，给它们 5 到 10 分钟的时间形成复合体，从而合成出 RNPs。” 赛默飞世尔公司合成生物学研发部高级主管 Jon Chesnut 说，“CRISPR RNPs 可通过脂质纳米粒子或电穿孔的方式传递到细胞中。”

虽然 RNP 试剂已被广泛使用，但近些年研究人员对它们的兴趣还停留在 CRISPR 方法的层面。“这是由于早期基于质粒的方法中有大量的 DNA 工具被广泛接受，大家还存在意识的盲区。” Dharmacon 公司（GE 医疗集团的子公司）高级产品经理 Louise Baskin 说。与质粒载体方法相比，无 DNA 的、基于 RNP 的 CRISPR 方法的好处在于没有意外 DNA 的插入，能够降低毒性，对目标效果更好，并且提高了特异性。

这些优点使得无 DNA 的 CRISPR 工具更适合于在治疗中应用。“对我们来说，在原代组织和原代细胞类型中的基因编辑能力是一个巨大的突破。” 加州大学旧金山分校（UCSF）细胞与分子药理学博士后 Judd Hultquist 说。

通过与 Kathrin Schumann（UCSF 医学院微生物学和免疫学博士后）合作，Hultquist 将 Dharmacon 公司 Edit-R 合成 gRNAs 的 RNPs 用在人原发性 T 细胞中，该细胞是艾滋病病毒的主要目标。现在他们正在开发一种基于 RNP 的平台，目标在于寻找能够提高 T 细胞对 HIV 感染抗性的遗传变化。

CRISPR 的核糖核蛋白的使用也彻底变革了模式动物系统（例如秀丽线虫）。对于秀丽线虫而言，CRISPR 是一个真正的游戏改变者。” 华盛顿大学医学研究所副教授 Brian Kraemer 说，他是 IDT 公司的无 DNA CRISPR 试剂的使用者。

将核糖核蛋白注入到线虫性腺区，可以进行生殖细胞的基因组编辑，随后可以分离出具有编辑表型的后代进行后续研究。Kraemer 的实验室利用线虫作为模式去识别蛋白质聚集疾病（如老年痴呆症和肌萎缩性侧索硬化症）的致病机制所需要的基因。

Kraemer 认为，新的 CRISPR 工具将引燃下一代线虫转基因模型，包括定制等位基因，依照实验的目的而改变基因编码蛋白，例如通过改变胞内转运蛋白的靶序列，可以使它定位到一个不同的细胞膜区域。

提高原代细胞（也包括其他细胞）CRISPR 的关键之一，是近期的增强试剂。IDT 公司开发了经过化学修饰的能够在胞内抵抗核酸酶降解的 gRNA。该公司还开发了两个短的 RNA 形式的 gRNAs（就像在原初细菌系统中），能够形成复合体，而不是单一的、更长的 gRNA。MilliporeSigma 公司也计划提供称为 “SygRNAs” 的两部合成 gRNAs。