载体（Vector）的概念/功能/分类

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

载体（Vector）的概念/功能/分类-表达载体与克隆载体的区别 1. 载体（Vector）的概念

把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。基因工程上所用的载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒(plasmids)、噬菌体（phage）、病毒（virus）等。

载体的功能及特征载体应具备的条件

运送外源基因高效转入受体细胞

为外源基因提供复制能力或整合能力

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

具有较高的外源DNA的载装能力

具有多具有合适的筛选标记

种单一的核酸内切酶识别切割位点

载体按功能可分成克隆载体和表达载体。

2. 克隆载体(Cloning Vector)

克隆载体大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

分类基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体
克隆载体 质粒载体 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）（1）具有合适的复制起始位点（ORI （2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 pSC101 ColE1 pBR322 pUC18 pUC19 TA载体
噬菌体载体 λ噬菌体其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。 (1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因 cⅠ 失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感） 1) 通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3) 外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5) 包装噬菌体颗粒的感染6)筛选插入式载体置换型载体
M13噬菌体载体 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌基因间隔区（intergenic region, IG区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。② IG区内只有一个 Bsu I 切点。（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 M13mpn n代表系列数字②对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。 M13mp2： LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点
噬菌体-质粒杂合载体 黏粒载体考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像 -DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。 cos 序列是噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。
噬菌粒载体能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重组操作简便，筛选容易噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件) 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体 1.具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2.编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3.拷贝数含量高 4.存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选 6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7.含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNA分子 8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA pUC118和pUC119
3. 表达载体（Expression Vectors）