【人物聚焦】免疫学杰出学者系列专题（四）

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在免疫系统中， T淋巴细胞和B淋巴细胞是特异性免疫防御的主力军，T细胞可分泌细胞因子，或直接杀伤靶细胞，介导细胞免疫应答；B细胞可以产生抗体介导体液免疫应答。2019年9月，美国著名的拉斯克基础医学奖（Albert Lasker Basic Medical Research Award）颁发给了美国埃默里大学医学院的Max Dale Cooper教授和澳大利亚沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所的Jacques Francis Miller教授，表彰他们为发现B淋巴细胞和T淋巴细胞所做出的贡献。
在上世纪60年代初期，虽然科学家们发现免疫系统能够抵抗感染，参与器官移植中的排斥反应等，但是淋巴细胞的具体免疫学功能和免疫器官到底是什么对于当时的学术界而言仍然是个谜。直到1961年，Jacques Miller教授在《The Lancet》杂志上发表论文，揭示了胸腺的免疫学功能。这一发现是免疫学研究历史上的重大突破。
Jacques Miller——胸腺不再是冗余的器官

Jacques Miller (Emeritus Professor, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research，Australia)
Jacques Miller，1931年4月2日出生于法国尼斯。由于父亲工作的原因，Miller教授小时候多在中国生活，但由于第二次世界大战的全面爆发，Miller教授全家在1941年移居澳大利亚。随后Miller教授进入悉尼大学学习，并在1955年获得医学学位。Miller教授的姐姐因为感染肺结核去世，因此Miller教授在悉尼大学期间选择了从事病毒感染研究。在1958年，Miller教授来到了英国伦敦癌症研究所，主要研究一种可能由病毒引起的淋巴细胞白血病，该肿瘤在某些小鼠品系自发，或用放射线、化学致癌物、新生期移植白血病小鼠的提取物可诱导小鼠发病。
1959年Miller教授发现，给新生小鼠注射淋巴细胞白血病组织（胸腺或者淋巴结）的提取物（cell-free），接着断奶后进行胸腺切除术，小鼠不会得淋巴细胞白血病，但如果再移植新生小鼠胸腺后又会复发淋巴细胞白血病[1, 2]。于是Miller教授假设淋巴细胞白血病的发生需要“病毒”在新生小鼠胸腺中复制。若摘除新生小鼠胸腺，注射白血病组织提取物，并观察这些去胸腺小鼠是否还会患上白血病。在实验过程中，Miller教授发现这些去胸腺小鼠刚开始的发育还算正常，但之后都慢慢消瘦，并最终死亡，甚至没注射过组织提取物的对照组也出现了同样的情况[3]。这一发现表明，胸腺并非像以往所认为的那样是无用的。

Miller教授对早亡的去胸腺小鼠进行解剖观察，发现它们的肝脏出现大面积病毒感染。并且对发病前的去胸腺小鼠进行皮肤移植实验，结果表明进行胸腺切除术后，这些小鼠对不同肤色的小鼠甚至大鼠的皮肤移植都不会产生免疫排斥反应（figure 1）[4]。但移植胸腺后，能够恢复这些小鼠的免疫排斥能力[5]。根据这一发现，Miller教授认为从胸腺离开的淋巴细胞是被选择过的；胸腺能够诱导自身耐受，抗原性物质可能会与胸腺中分化的某些细胞接触，并防止这些细胞成熟到能够发生免疫反应的阶段（也就是现在所说的T细胞阴性选择），他称之为“selective immunological thymectomy”。Miller教授在1963和1965发表的文献中还证明胸腺会影响肿瘤的生长，摘除胸腺的小鼠肿瘤生长更快[6, 7]。这些结果证明胸腺具有重要的免疫功能，是一种重要的免疫器官。

Figure 1 Immunodeficient Neonatally Thymectomized Mouse (Miller JF. A Scientific Odyssey: Uncovering the Secrets of Thymus Function. Cell. 2019)
这一发现在当时颠覆了科学界的认知，并不被科学界认可。毕竟在当时科学界普遍认为胸腺是一个冗余的器官，他们认为这些结果可能是Miller教授在实验过程中发生了污染导致的（Miller教授当时是在由马厩改造的实验室中进行的实验）。为此，Miller教授来到当时唯一有着无菌小鼠的地方——美国国家卫生研究院（National Institutes of Health），在无菌环境中也同样重复出了这项结果。
1962年，Robert Good和Byron Waksman的研究团队分别在小鼠和大鼠中也得出了相似的结果[8, 9]。随着学术界逐渐认可胸腺是一种免疫功能器官，科学家开始研究胸腺的具体作用。与此同时，Max Cooper教授1965年发表在《Nature》杂志上的论文，揭示了可能有两个不同的淋巴细胞群的存在[10]。
Max Cooper——法氏囊中发现第二类淋巴细胞群

Max D. Cooper (Emory University School of Medicine, USA)
Max Dale Cooper，1933年8月31日出生于美国密西西比州。1957年从杜兰大学医学院获得了医学博士学位，成为了一名儿科医生。他发现Wiskott–Aldrich综合征患儿免疫功能缺陷，缺乏对病毒的抗感染能力，但体内的抗体水平非常高；而先天性丙种球蛋白缺乏症的患儿体内缺乏抗体，但存在对病毒的抗感染能力。Cooper教授对此非常感兴趣，并在1963年，加入了Robert A. Good实验室进行研究。
早在1956年，Bruce Glick发现，从鸡体内去除法氏囊后，可造成鸡体内抗体含量显著降低[11]。Frank MacFarlane Burnet（1960年诺贝尔奖得主）实验团队在1962年发表的文献表明，向鸡卵注射睾酮来破坏法氏囊的发育后，胸腺正常的鸡产生抗体减少，但还是存在免疫排斥反应；而那些胸腺萎缩的鸡，免疫排斥反应消失了[12]。根据以上的研究发现，Max Cooper教授对鸡进行了胸腺切除术或法氏囊切除术，并用辐照处理。结果发现，经法氏囊切除术的鸡不能产生抗体；而经胸腺切除术的鸡可以产生抗体，但严重缺乏淋巴细胞[10]。这一结果说明了鸡体内很可能存在两类来源不同，功能不同的淋巴细胞群，法氏囊来源的细胞（根据法氏囊Bursa首字母称之为B细胞）主要介导抗体的生成，而胸腺来源的细胞（根据胸腺Thymus首字母称之为T细胞）主要作用于迟发型超敏反应和免疫排斥反应[13]。

与此同时，1965年Miller教授来到了沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所，与他的第一个博士生Graham Mitchell一起开展实验。他们通过胸导管插管获得淋巴细胞，比较发现，进行了胸腺切除术的小鼠获得的细胞要比正常小鼠（进行了假操作）少，并且认为进行胸腺切除术的小鼠胸导管中存在的淋巴细胞属于另一群非胸腺来源的淋巴细胞[14]。在这之后，Miller教授和Graham Mitchell又给做过胸腺切除术并接受过辐射的小鼠注射了CBA和C57BL杂交小鼠的胸导管淋巴细胞和CBA来源的骨髓细胞，接着通过溶血空斑实验（用绵羊红细胞SRBC免疫小鼠后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在琼脂糖凝胶中。其中含有的抗SRBC抗体在补体参与下会导致SRBC溶解，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑。每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少），查看抗体产生情况。结果发现，使用了CBA小鼠来源的抗体后，空斑消失了86%~96%；而使用C57BL小鼠来源的抗体后空斑几乎没有减少（figure 2）。这一发现表明胸腺来源的细胞并不是产生抗体的细胞，抗体主要来源于骨髓产生的细胞，并于1968年在《Journal of Experimental Medicine》杂志上发表了这一结果[15]。

Figure 2 Thymus-derived cells were not antibody-forming cell precursors (Miller JF. A Scientific Odyssey: Uncovering the Secrets of Thymus Function. Cell. 2019)
到20世纪60年代中后期，学术界基本接受两类淋巴细胞群的存在。但人和小鼠等哺乳动物体内都不存在法氏囊，那么在哺乳动物中与禽类法氏囊相对应的器官是什么呢？科学家们开始寻找哺乳动物中的法氏囊。
在1974年，Cooper教授和英国伦敦学院大学的两位科学家Martin Raff 和 John Owen，使用小鼠胚胎肝脏细胞时培养出了B淋巴细胞[16]。同一年，来自澳大利亚沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所的Nossal团队和日内瓦大学的Vassalli团队，使用小鼠骨髓也培养出了B淋巴细胞（骨髓Bone marrow首字母也是B）[17, 18]。就这样，在1974年科学家们找到了哺乳动物中产生B细胞的器官。

此外，Cooper教授发现能够表达IgM和IgG的淋巴细胞分别在鸡胚第14天和第21天时初次出现。随后，Cooper教授将IgM的山羊抗体注射到第13天的鸡胚绒毛膜血管中，并且于孵化后（正常情况下血浆中已存在IgM和IgG）摘除法氏囊以去除其中会生成抗体的B细胞，结果发现IgM和IgG的合成均被抑制；然而，孵化后摘除法氏囊，再使用IgM的山羊抗体，则只会抑制IgM的合成，而不影响IgG的水平。这一结果说明了免疫球蛋白类别转换的存在[19]。

之后Cooper教授致力于关注免疫系统的进化和演变过程。他注意到了七鳃鳗——一类属于无颌脊椎动物的古老生物。他发现，七鳃鳗中存在可变的淋巴细胞受体（VLR）[20]，它类似于有颌类脊椎动物中的免疫球蛋白型抗原受体, 行使T/B淋巴细胞受体的功能。不同于有颌脊椎动物的V(D)J重组，在无颌类脊椎动物适应性免疫系统中，通过LRR模块的重排形成多种多样的VLR来识别特异性抗原（figure 3）。

Figure 3 Variable lymphocyte receptors (VLR)(Cooper MD, Alder MN. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 2006）
上世纪六七十年代是免疫学研究的蓬勃发展期，科学家们又陆续发现了T细胞和B细胞存在相互作用，T细胞和B细胞的来源和迁移路径，MHC分子的作用和T细胞的亚型等等。

Key events in understanding the function of the thymus.（Miller JF. The golden anniversary of the thymus. Nat Rev Immunol. 2011）

A timeline of the early history of B cells. （Cooper MD. The early history of B cells. Nat Rev Immunol. 2015）
小结
T细胞和B细胞的发现是免疫学发展中的重要里程碑，是现代免疫学的奠基石，Miller教授和Cooper教授为此做出了巨大的贡献，为免疫学研究开启了新篇章。
参考文献：
1. Miller JF. Role of the thymus in murine leukaemia. Nature. 1959;183(4667):1069.
2. Miller JF. Fate of subcutaneous thymus grafts in thymectomized mice inoculated with leukaemic filtrate. Nature. 1959;184(Suppl 23):1809-10.
3. Miller JF. Analysis of the thymus influence in leukaemogenesis. Nature. 1961;191:248-9.
4. Miller JF. Immunological function of the thymus. Lancet. 1961;2(7205):748-9.
5. Miller JFAP, Haddow A. Effect of neonatal thymectomy on the immunological responsiveness of the mouse. 1962;156(964):415-28.
6. Miller JF, Grant GA, Roe FJ. Effect of Thymectomy on the Induction of Skin Tumours by 3,4-Benzopyrene. Nature. 1963;199:920-2.
7. Grant GA, Miller JF. Effect of neonatal thymectomy on the induction of sarcomata in C57 BL mice. Nature. 1965;205(976):1124-5.
8. Arnason BG, Jankovic BD, Waksman BH. Effect of thymectomy on 'delayed' hypersensitive reactions. Nature. 1962;194:99-100.
9. Dalmasso AP, Martinez C, Good RA. Further Studies of Suppression of the Homograft Reaction by Thymectomy in the Mouse. 1962;111(1):143-6.
10. Cooper MD, Peterson RD, Good RA. Delineation of the Thymic and Bursal Lymphoid Systems in the Chicken. Nature. 1965;205:143-6.
11. Glick B, Chang TS, Jaap RG. The Bursa of Fabricius and Antibody Production. Poultry Sci. 1956;35(1):224-5.
12. Warner NL, Szenberg A, Burnet FM. The immunological role of different lymphoid organs in the chicken. I. Dissociation of immunological responsiveness. Aust J Exp Biol Med Sci. 1962;40:373-87.
13. Cooper MD, Raymond DA, Peterson RD, South MA, Good RA. The functions of the thymus system and the bursa system in the chicken. J Exp Med. 1966;123(1):75-102.
14. Miller JF, Mitchell GF, Weiss NS. Cellular basis of the immunological defects in thymectomized mice. Nature. 1967;214(5092):992-7.
15. Miller JF, Mitchell GF. Cell to cell interaction in the immune response. I. Hemolysin-forming cells in neonatally thymectomized mice reconstituted with thymus or thoracic duct lymphocytes. J Exp Med. 1968;128(4):801-20.
16. Owen JJ, Cooper MD, Raff MC. In vitro generation of B lymphocytes in mouse foetal liver, a mammalian 'bursa equivalent'. Nature. 1974;249(455):361-3.
17. Ryser JE, Vassalli P. Mouse Bone-Marrow Lymphocytes and Their Differentiation. Journal of Immunology. 1974;113(3):719-28.
18. Osmond DG, Nossal GJ. Differentiation of lymphocytes in mouse bone marrow. II. Kinetics of maturation and renewal of antiglobulin-binding cells studied by double labeling. Cell Immunol. 1974;13(1):132-45.
19. Kincade PW, Lawton AR, Bockman DE, Cooper MD. Suppression of immunoglobulin G synthesis as a result of antibody-mediated suppression of immunoglobulin M synthesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1970;67(4):1918-25.
20. Pancer Z, Amemiya CT, Ehrhardt GRA, Ceitlin J, Gartland GL, Cooper MD. Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey. Nature. 2004;430(6996):174-80.
来源：B809

1980-2020
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原标题：《【人物聚焦】免疫学杰出学者系列专题（四）——Max Cooper & Jacques Miller》

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