MSD免疫分析检测方法开发

作者：张馨予

利用一种钌的衍生物 (Sulfo-tag) 对抗原进行标记，通过与生物素标记的抗原共同捕获血清中抗体，然后与包被有链霉亲和素的 MSD 平板结合，形成链霉亲和素 - 生物素标记抗原 - 抗体 - 钌的衍生物标记抗原的体系。通过 MSD 超敏电化学发光仪对 MSD 平板底部电级通电，检测发光信号并进行分析。

1、生物素标记药物

生物素的标记比例与被标记药物的分子量大小和赖氨酸残基（活性伯氨基团）有关。一般的起始标记的偶联比为 10:1 或 20:1 。生物素化的效率取决于可用赖氨酸残基的数量、药物的浓度和标记反应的 pH 值。如果用生物素标记时发生沉淀，则使用较低的偶联比例。本实验采用 10:1 的偶联比进行标记。标记上的生物素并不要求越多越好，通常每个药物 2-4 个生物素就足够了。药物标记前应用过滤柱除去共轭成分，标记后也需过过滤柱除去未标记上的生物素和药物。标记结束后可用试剂盒测定标记量。

2、SULFO-TAG NHS-Ester标记药物

（1）在开始偶联反应之前，必须使用脱盐柱通过缓冲交换除去药物中防腐剂，如叠氮化钠或EDTA，含有伯胺的缓冲成分(如三胺、甘氨酸)和甘油。注意:在这个阶段不应该使用共轭存储缓冲区。标记偶联温度为23°C(20-25°C)，避光。抗体药物浓度不能低于0.5mg/mL(最好1-2mg/mL)。

（2）在23°C的偶联温度下平衡将要偶联的蛋白。可接受的温度范围为20°C至25°C。根据蛋白质的含量，达到平衡需要10-30分钟。

（3）根据下面的公式计算共轭反应所需的SULFO-TAG NHS-Ester储备溶液的量。

（4）将SULFO-TAG NHS-Ester涡旋1分钟或轻拍表面，收集瓶底部冻干物质。立即将150nmol SULFO-TAG NHS-Este用50µL冰纯化水配制为3nmol/µL的溶液。轻轻旋转小瓶，确保所有冻干粉完全溶解。

（5）根据计算的结果将溶解后的SULFO-TAG NHS-Ester溶液加入到需标记的蛋白中，立即涡旋混匀。

（6）避光，23℃(20°C至25°C可接受)孵育2小时。注意在多个制备批次之间保持一致的结合条件，以确保标记的可重复性。

（7）孵化结束后。过纯化柱，2-8°C的离心机离心。

（8）建议使用0.2µm过滤器过滤结合蛋白质。

（9）使用标准比色蛋白测定法测定标记后蛋白浓度，如BCA、Bradford或Lowry，确定共轭蛋白的摩尔蛋白浓度。（注：不要使用OD280吸光度读数，因为SULFO-TAG NHS-Ester也会吸收该波长的光。）

（10）使用分光光度计在455nm处测定SULFO-TAG NHS-Ester标记蛋白中SULFO-TAG NHS-Ester的吸光度。将测量值除以路径长度(cm)，再除以标记的消光系数(15，400 M -1cm-1)，得到SULFO-TAG NHS-Ester标记浓度(mol / L)。公式计算如下。

（11）将步骤10中测定的SULFO-TAG NHS-Ester浓度值除以步骤9中测定的摩尔蛋白浓度值，计算出SULFO-TAG NHS-Ester标记蛋白的偶联率。

（12）SULFO-TAG NHS-Ester标记抗体通常在2-8°C浓度为1-2mg /mL时至少稳定2年;其他类型的蛋白质的稳定性需要确定。也可以在≤-20°C或≤-70°C冷冻保存。SULFO-TAG NHS-Ester标记蛋白对长时间的光照敏感，应储存在黑暗、琥珀色或不透明的小瓶中。在进行分析时，偶联物短时间暴露在光线下影响不大。如果蛋白浓度较低(< 0.1 mg/mL)，可考虑添加载体蛋白，如0.1% MSD封闭液A。

1、优化试剂浓度和检测灵敏度(链霉亲和素板)

a. 使用等摩尔量的生物素标记药物和SULFO-TAG标记药物检测灵敏度。Sulfo-tag标记物药物与生物素标记物药物1：1混合后（0.25、0.5、1μg/mL）再与不同浓度（10000; 2500; 625; 156.3; 39.1; 9.8; 2.4 and 0 ng/mL）抗药抗体(ADA)混合，并考察在不同浓度血清中反应。注：对于链霉亲和素板中每孔终浓度不超过0.3 pmol的生物素化标记药物。如下图。

b. 棋盘法筛选生物素标记药物和SULFO-TAG标记药物最佳比例浓度。